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本试剂盒是基于转录介导的扩增技术(TMA)，即利用RNA聚合酶和逆转录酶在42℃左右等温反应条件下来扩增RNA的系统。


TMA技术首先需要针对靶序列设计一对特异性引物，其中引物1的5端带有T7 RNA聚合酶识别的启动子序列，这一引物与靶序列结合后，在逆转录酶的作用下进行逆转录反应，合成cDNA。在M-MLV逆转录酶的RNase H活性作用下靶标RNA链降解，形成单链cDNA。随后，引物2与cDNA结合，在M-MLV逆转录酶的DNA聚合酶活性作用下产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，该双链带有T7启动子。在T7 RNA聚合酶的作用下，一条DNA双链上产生多个（100～1000个）RNA拷贝。最后，这些转录本又可以作为TMA的起始模板，重复上述步骤。

反应结束后，可用杂交保护实验（HPA）对RNA产物进行检测。也可通过SAT技术检测，该设计基于TMA恒温扩增技术发展起来的一项最新核酸检测技术，带有荧光标记的分子信标和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况，整个扩增过程都在同一温度（42℃）下进行。

组分	50T	250T
8×TMA Enzyme Mix	125μL	625μL
2×TMA Reaction Buffer	500μL	1.25mL×2
Control Primer 1 (20μM)	30μL	30μL
Control Primer 2 (20μM)	30μL	30μL
Control Probe (FAM-BHQ1)(20μM)	15μL	15μL
Control Tatget RNA (100ng/μL)	20μL	20μL
RNase-Free Water	1mL	1mL×5

保存：-70℃


无大肠杆菌DNA残留、无核酸内、外切酶残留及RNase残留。

• 用于反应的RNA在使用之前应进行纯化并溶解于无核酸酶水。
  
• 在配置反应体系时，推荐使用RNase抑制剂以增强反应中RNA的稳定性。
  
• 保持RNase-free环境，推荐使用RNase free离心管和枪头。
  
• 可根据以下说明设计TMA引物。
  primer 1序列为：5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’。
  其中，该序列AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA为T7启动子识别序列。T7启动子识别序列后的序列为与靶标序列完全互补序列，一般设置20～35nt。
  primer 2与靶标序列一致，一般设置20～35nt。
  
• SAT检测用到的荧光探针为分子信标，两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎环结构，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。

可根据实验需要放大或缩小体系。依次加入以下各组分：

成分	用量
2×TMA Reaction Buffer	10μL
Primer 1 (20μM)	0.35μL
Primer 2 (20μM)	0.35μL
Probe (FAM-BHQ1) (20μM)	0.2μL
Target RNA	100fg-1μg
RNase-Free Water	至17.5μL
65℃，10min。42℃，5min。
8×TMA Enzyme Mix	2.5μL
42℃每反应30～60s收集一次荧光，80-99 cycles。

注：若不采用推荐的SAT检测方式，也可将体系中的Probe去除。42℃，20～30min后对产物RNA进行相关检测。
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